Theo dõi sức khỏe của các cơ quan rắn sau khi cấy ghép bằng DNA không có tế bào

Chẩn đoán dựa trên cfDNA có thể làm cho sinh thiết mô bị lỗi thời
Costly and invasive tissue biopsies to detect allograft rejection after transplantation have numerous limitations. Sinh thiết mô tốn kém và xâm lấn để phát hiện thải ghép allograft sau khi cấy ghép có nhiều hạn chế. Assays based on cell-free DNA (cfDNA)—circulating fragments of DNA released from cells, tissues, and organs as they undergo natural cell death—have been intensively studied recently and could ultimately improve our ability to detect rejection, implement earlier changes in management, and even enhance the long-term survival of transplanted organs. Các xét nghiệm dựa trên các đoạn DNA DNA không có tế bào (cfDNA) được giải phóng từ các tế bào, mô và cơ quan khi chúng trải qua quá trình chết tế bào tự nhiên đã được nghiên cứu gần đây và cuối cùng có thể cải thiện khả năng phát hiện sự từ chối của chúng tôi, thực hiện các thay đổi trước đó trong quản lý và thậm chí tăng cường sự tồn tại lâu dài của các cơ quan cấy ghép.
CfDNA assays that circumvent the need for whole-genome sequencing (WGS) and the need for a priori knowledge of donor and/or recipient genotypes have powerful logistical advantages and are currently under clinical scrutiny. CfDNA khẳng định rằng cần tránh sự giải trình tự bộ gen (WGS) và nhu cầu hiểu biết về các kiểu gen của người cho và / hoặc người nhận có lợi thế hậu cần mạnh mẽ và hiện đang được nghiên cứu kỹ lưỡng. In addition, improving knowledge of the organ-specific kinetics of donor-derived cfDNA (dd-cfDNA) following transplantation has also helped optimize these assays. Ngoài ra, việc nâng cao kiến ​​thức về động lực học cụ thể của cơ quan của cfDNA có nguồn gốc từ người hiến tặng (dd-cfDNA) sau ghép cũng đã giúp tối ưu hóa các xét nghiệm này. Laboratories also have introduced alternative methods for quantifying dd-cfDNA, such as digital droplet polymerase chain reaction (PCR) and organ-specific DNA methylation patterns. Các phòng thí nghiệm cũng đã giới thiệu các phương pháp thay thế để định lượng dd-cfDNA, chẳng hạn như phản ứng chuỗi polymerase giọt kỹ thuật số (PCR) và các mẫu methyl hóa DNA đặc trưng của cơ quan. As such, the field of minimally invasive diagnostics based upon cfDNA is increasingly promising, one day potentially replacing traditional tissue biopsies. Do đó, lĩnh vực chẩn đoán xâm lấn tối thiểu dựa trên cfDNA đang ngày càng hứa hẹn, một ngày nào đó có khả năng thay thế sinh thiết mô truyền thống.
VAI TRÒ CỦA CFDNA TRONG GIỚI HẠN ORGAN
Rejection, referring to injury of a donated organ caused by the recipient's immune system, can cause allograft dysfunction and even patient death. Từ chối, đề cập đến chấn thương của một cơ quan hiến tặng gây ra bởi hệ thống miễn dịch của người nhận, có thể gây ra rối loạn chức năng giả kim và thậm chí tử vong bệnh nhân. T-cell mediated acute cellular rejection (ACR) occurs most often within the first 6 months post-transplant (1). Từ chối tế bào cấp tính qua trung gian tế bào T (ACR) xảy ra thường xuyên nhất trong vòng 6 tháng đầu sau ghép (1). ACR involves accumulation of CD4+ and CD8+ T-cells in the interstitial space of the allograft as the recipient's immune system recognizes antigens on the donated organ as foreign. ACR liên quan đến sự tích tụ của các tế bào T CD4 + và CD8 + trong không gian xen kẽ của allograft khi hệ thống miễn dịch của người nhận nhận ra các kháng nguyên trên cơ quan được hiến tặng là ngoại lai. These T-cells initiate an immune cascade that ultimately leads to programmed cell death (apoptosis) of the targeted cells. Các tế bào T này khởi tạo một tầng miễn dịch mà cuối cùng dẫn đến cái chết tế bào được lập trình (apoptosis) của các tế bào được nhắm mục tiêu. As these cells die, genomic DNA is cleaved and fragments of dd-cfDNA, measuring approximately 140 base pairs (bp) in length, are released to join the pool of recipient cfDNA in the blood and ultimately excreted in the urine (2). Khi các tế bào này chết đi, DNA bộ gen bị phân cắt và các mảnh dd-cfDNA, đo được khoảng 140 cặp bazơ (bp), được giải phóng để tham gia vào nhóm cfDNA của người nhận trong máu và cuối cùng được bài tiết qua nước tiểu (2).
Circulating cfDNA has recently been leveraged as a diagnostic tool to replace invasive biopsies in other areas of medicine, including analyzing fetal DNA fragments within the maternal circulation to identify genetic abnormalities in utero and sequencing circulating DNA released from tumor cells to identify cancer-related mutations. CfDNA lưu hành gần đây đã được sử dụng như một công cụ chẩn đoán để thay thế sinh thiết xâm lấn trong các lĩnh vực y học khác, bao gồm phân tích các đoạn DNA của thai nhi trong tuần hoàn của mẹ để xác định các bất thường di truyền trong tử cung và giải trình tự DNA lưu hành từ các tế bào khối u để xác định các đột biến liên quan đến ung thư. In both these cases as well as in transplantation, high-throughput sequencing that identifies and quantifies DNA sequence differences distinguishes between the two different populations of cfDNA derived from distinct sources (2). Trong cả hai trường hợp này cũng như trong cấy ghép, giải trình tự thông lượng cao xác định và định lượng sự khác biệt trình tự DNA phân biệt giữa hai quần thể cfDNA khác nhau có nguồn gốc từ các nguồn khác nhau (2). Three characteristics of cfDNA make it an excellent noninvasive candidate biomarker to detect rejection after solid organ transplantation: It can be obtained from a simple blood draw, its concentration accurately measured, and its nucleotide sequence easily identified. Ba đặc điểm của cfDNA làm cho nó trở thành một dấu ấn sinh học không xâm lấn tuyệt vời để phát hiện sự thải ghép sau khi ghép tạng rắn: Nó có thể thu được từ việc lấy máu đơn giản, đo nồng độ chính xác và trình tự nucleotide của nó dễ dàng xác định. Using cfDNA as a biomarker for ACR is also advantageous since it is derived from the injured cells of the donated organ and therefore should represent a direct measure of cell death occurring in the allograft. Sử dụng cfDNA như một dấu ấn sinh học cho ACR cũng rất thuận lợi vì nó có nguồn gốc từ các tế bào bị tổn thương của cơ quan được hiến tặng và do đó sẽ đại diện cho một biện pháp trực tiếp về cái chết của tế bào xảy ra trong allograft. Furthermore, cfDNA maintains all of the genetic features of the original genomic DNA, allowing the genetic material released from the donated organ to be differentiated from the cfDNA derived from cells of the recipient that are undergoing natural apoptosis (3). Hơn nữa, cfDNA duy trì tất cả các đặc điểm di truyền của DNA bộ gen ban đầu, cho phép vật liệu di truyền được giải phóng từ cơ quan hiến tặng được phân biệt với cfDNA có nguồn gốc từ các tế bào của người nhận đang trải qua quá trình tự hủy tự nhiên (3).
Frequent and accurate monitoring of allograft health is essential for transplant recipients' long-term survival. Theo dõi thường xuyên và chính xác về sức khỏe của allograft là điều cần thiết cho sự sống còn lâu dài của người nhận ghép tạng. For heart transplantation (HT), endomyocardial biopsy (EMB) is the current gold standard for detecting ACR (4). Đối với ghép tim (HT), sinh thiết nội mô (EMB) là tiêu chuẩn vàng hiện tại để phát hiện ACR (4). However, EMBs are costly with significant limitations, many of which are common to all organ biopsies (5-7). Tuy nhiên, EMB rất tốn kém với những hạn chế đáng kể, nhiều trong số đó là phổ biến đối với tất cả các sinh thiết nội tạng (5-7). Moreover, the invasive nature of EMBs puts HT patients at risk for complications (6,8,9). Hơn nữa, bản chất xâm lấn của EMBs khiến bệnh nhân HT có nguy cơ bị biến chứng (6,8,9).
Unfortunately, currently available noninvasive methods including echocardiography or magnetic resonance imaging (MRI) lack sufficient specificity and sensitivity to reliably detect rejection (10-13). Thật không may, các phương pháp không xâm lấn hiện có bao gồm siêu âm tim hoặc chụp cộng hưởng từ (MRI) thiếu đủ độ đặc hiệu và độ nhạy để phát hiện sự từ chối đáng tin cậy (10-13). Blood-based biomarkers, such as cfDNA, represent a promising alternative that could be readily implemented into clinical practice (14-17). Các dấu ấn sinh học dựa trên máu, chẳng hạn như cfDNA, đại diện cho một sự thay thế đầy hứa hẹn có thể dễ dàng thực hiện trong thực hành lâm sàng (14-17).
KINETICS CỦA CFDNA NÓI CHUYỆN VÀ GIỚI HẠN
Since cfDNA originates from the naturally occurring process of apoptosis, all individuals have detectable levels of cfDNA in their blood (18). Vì cfDNA bắt nguồn từ quá trình apoptosis xảy ra tự nhiên, tất cả các cá nhân đều có mức độ cfDNA có thể phát hiện được trong máu của họ (18). For healthy individuals, the majority of circulating cfDNA comes from hematopoietic cells that have undergone natural death related to cellular turnover. Đối với những người khỏe mạnh, phần lớn cfDNA lưu hành đến từ các tế bào tạo máu đã trải qua cái chết tự nhiên liên quan đến sự thay đổi của tế bào. Levels of cfDNA fluctuate for multiple reasons including infection, surgery, trauma, or even exhaustive exercise (2,19). Mức độ cfDNA dao động vì nhiều lý do bao gồm nhiễm trùng, phẫu thuật, chấn thương hoặc thậm chí tập thể dục toàn diện (2,19). Therefore, developing a cfDNA-based assay to detect rejection requires assessing the expected kinetics of dd-cfDNA release into the recipient's circulation post-transplant. Do đó, việc phát triển một xét nghiệm dựa trên cfDNA để phát hiện sự từ chối đòi hỏi phải đánh giá động lực học dự kiến ​​của việc phát hành dd-cfDNA vào sau ghép tuần hoàn của người nhận. This consideration is especially important since the release of dd-cfDNA over time post-transplant is organ-specific (20-22). Việc xem xét này đặc biệt quan trọng vì việc phát hành dd-cfDNA theo thời gian sau ghép là đặc hiệu của cơ quan (20-22).
For example, at 1 day post-HT the average level of dd-cfDNA is 3.8 ± 2.3% (20). Ví dụ, sau 1 ngày sau HT, mức độ trung bình của dd-cfDNA là 3,8 ± 2,3% (20). However, by 7 days the level of dd-cfDNA has declined rapidly and remains consistently low (<1%). Tuy nhiên, sau 7 ngày, mức độ dd-cfDNA đã giảm nhanh chóng và vẫn ở mức thấp (<1%). During an episode of acute rejection in the heart, the level of dd-cfDNA was found to increase to 4%–5% from a baseline of about 0.06% observed during quiescence. Trong giai đoạn từ chối cấp tính trong tim, mức độ dd-cfDNA đã được tìm thấy tăng lên 4% 5% so với mức cơ bản khoảng 0,06% được quan sát thấy trong quá trình hoạt động. The kinetics of dd-cfDNA observed in the circulation of HT recipients was similar to that observed after renal transplantation (22). Động lực học của dd-cfDNA được quan sát thấy trong sự lưu thông của người nhận HT tương tự như quan sát thấy sau khi ghép thận (22).
In contrast, recipients of bilateral lung transplants were found to have an average dd-cfDNA fraction of 26 ± 14% on the first postoperative day. Ngược lại, những người nhận ghép phổi hai bên được tìm thấy có tỷ lệ dd-cfDNA trung bình là 26 ± 14% vào ngày hậu phẫu đầu tiên. Furthermore, the reduction in dd-cfDNA was characterized by levels of dd-cfDNA that declined rapidly within the first week but then slowed and generally remained at 1%–3% (21). Hơn nữa, việc giảm dd-cfDNA được đặc trưng bởi mức độ dd-cfDNA giảm nhanh trong tuần đầu tiên nhưng sau đó chậm lại và thường duy trì ở mức 1% 3% (21). However, similar to heart and kidney transplants during an episode of acute rejection, the level of dd-cfDNA increased significantly, climbing to an average of 14%–15%. Tuy nhiên, tương tự như ghép tim và thận trong giai đoạn thải ghép cấp tính, mức độ dd-cfDNA tăng đáng kể, leo lên mức trung bình 14% 15%.
Differences in tissue mass and rates of cellular turnover account for this variability in the levels of dd-cfDNA released early post-transplant and during quiescence. Sự khác biệt về khối lượng mô và tốc độ thay đổi tế bào chiếm tỷ lệ thay đổi về mức độ dd-cfDNA được phát hành sớm sau ghép và trong quá trình hoạt động. For example, differences in circulating dd-cfDNA levels in quiescent bilateral and single-lung transplants can be explained by the difference in cellular turnover, being 107 vs. 58 cells/second, respectively (21). Ví dụ, sự khác biệt trong việc lưu hành nồng độ dd-cfDNA trong cấy ghép hai bên và đơn phổi có thể được giải thích bằng sự khác biệt về doanh thu tế bào, tương ứng là 107 so với 58 tế bào / giây (21). By contrast, in a quiescent transplanted heart, the cellular turnover rate is only 8 cells/second (21-23). Ngược lại, trong một trái tim được cấy ghép yên tĩnh, tốc độ quay vòng của tế bào chỉ là 8 tế bào / giây (21-23). Thus, an understanding of the expected levels of dd-cfDNA associated with a given solid organ is essential to facilitate development of organ-specific assays that detect rejection. Do đó, sự hiểu biết về mức độ dự kiến ​​của dd-cfDNA liên quan đến một cơ quan rắn nhất định là điều cần thiết để tạo điều kiện phát triển các xét nghiệm đặc hiệu cho cơ quan phát hiện thải ghép. Once the kinetics of cfDNA release for a particular organ are understood, several methods exist for quantifying the relative amount of dd-cfDNA. Khi động lực của việc phát hành cfDNA cho một cơ quan cụ thể được hiểu, một số phương pháp tồn tại để định lượng lượng dd-cfDNA tương đối.
STRATEGIES TO DISTINGUISH RECIPIENT- VS. CHIẾN LƯỢC ĐỂ TIẾP TỤC TUYỆT VỜI- VS. DONOR-DERIVED CFDNA CFDNA DERORED DERIVED
Nhà tài trợ-Người nhận Giới tính-Không phù hợp
For organ transplants in which the donor is male and the recipient is female, laboratories can leverage this sex mismatch to calculate dd-cfDNA levels from within the recipient's total cfDNA pool (17). Đối với các ca ghép tạng trong đó người hiến tặng là nam và người nhận là nữ, các phòng thí nghiệm có thể tận dụng sự không phù hợp giới tính này để tính toán mức độ dd-cfDNA từ trong tổng số cfDNA của người nhận (17). Researchers first demonstrated the feasibility of this approach in urine samples taken from female renal transplant recipients who had received a kidney from male donors and when they experienced rejection demonstrated elevated levels of dd-cfDNA in their urine that specifically contained regions found on the Y chromosome (17). Các nhà nghiên cứu lần đầu tiên chứng minh tính khả thi của phương pháp này trong các mẫu nước tiểu lấy từ những người nhận ghép thận nữ đã nhận được thận từ các nhà tài trợ nam và khi họ bị từ chối đã chứng minh nồng độ dd-cfDNA tăng cao trong nước tiểu có chứa vùng nhiễm sắc thể Y ( 17). Although this approach allows for confident diagnosis of rejection in the allograft, sex-mismatch between the donor and recipient is relatively infrequent and not universally applicable. Mặc dù phương pháp này cho phép chẩn đoán tự tin từ chối trong allograft, nhưng sự không phù hợp giới tính giữa người cho và người nhận tương đối không thường xuyên và không được áp dụng phổ biến.
Sự khác biệt trình tự DNA của người nhận và người nhận
An organ transplant can also be regarded as a genome transplant, as the cells within a transplanted organ contain the genetic information of its donor. Ghép tạng cũng có thể được coi là ghép gen, vì các tế bào trong cơ quan được cấy ghép chứa thông tin di truyền của người hiến tặng. As such, the concept of genome transplant dynamics (GTD) relies on the presence of genetic differences between the donor and recipient at a particular locus, which then can be leveraged to identify the origin of the circulating cfDNA (20-24). Như vậy, khái niệm về động lực ghép gen (GTD) dựa vào sự hiện diện của sự khác biệt di truyền giữa người cho và người nhận tại một địa điểm cụ thể, sau đó có thể được sử dụng để xác định nguồn gốc của cfDNA lưu hành (20-24). Ideally, the recipient would be homozygous for a single base (for example, AA) and at the same locus the donor would be homozygous for a different base (for example, GG). Lý tưởng nhất, người nhận sẽ đồng hợp tử cho một cơ sở duy nhất (ví dụ: AA) và tại cùng một địa điểm, nhà tài trợ sẽ đồng hợp tử cho một cơ sở khác (ví dụ: GG).
Given the genetic heterogeneity between individuals, tens of thousands of potentially informative loci across the genome can be interrogated using high-throughput sequencing to distinguish dd-cfDNA from recipient cfDNA (20,24). Do tính không đồng nhất về gen giữa các cá thể, hàng chục ngàn locus có khả năng cung cấp thông tin trên bộ gen có thể được thẩm vấn bằng cách sử dụng trình tự thông lượng cao để phân biệt dd-cfDNA với cfDNA của người nhận (20,24). This concept was first illustrated using banked samples from cardiac donors to obtain a priori donor genotypes for each donor-recipient pairing. Khái niệm này lần đầu tiên được minh họa bằng cách sử dụng các mẫu được đánh dấu từ các nhà tài trợ tim để có được kiểu gen của người hiến tặng cho mỗi cặp người nhận và người nhận. After extracting and sequencing cfDNA from each recipient, the fraction of donor-specific molecules was determined. Sau khi trích xuất và giải trình tự cfDNA từ mỗi người nhận, phần nhỏ của các phân tử dành riêng cho người hiến đã được xác định. In samples taken during or immediately preceding a biopsy-proven rejection event, the proportion of donor-specific single nucleotide polymorphisms (SNPs) was found to have increased from <1% to >3%–4% (24). Trong các mẫu được lấy trong hoặc ngay trước sự kiện loại bỏ sinh thiết đã được chứng minh bằng sinh thiết, tỷ lệ đa hình nucleotide đơn đặc biệt của người hiến tặng (SNPs) đã được tìm thấy đã tăng từ <1% đến> 3% 5% (24).
This early retrospective study has now been validated prospectively. Nghiên cứu hồi cứu sớm này hiện đã được xác nhận trong tương lai. Adult and pediatric heart and lung transplant recipients were recruited and genotypes for each donor-recipient pair were obtained through WGS with an average of 53,423 informative SNP markers identified (20). Người nhận ghép tim và phổi ở người trưởng thành và trẻ em đã được tuyển dụng và kiểu gen cho mỗi cặp người nhận - người nhận được thông qua WGS với trung bình 53,423 dấu SNP thông tin được xác định (20). Overall, early detection of acute rejection was superior to that of AlloMap, the first Food and Drug Administration-approved non-invasive approach to detecting ACR after HT based on transcriptome analysis (25). Nhìn chung, phát hiện sớm từ chối cấp tính vượt trội so với AlloMap, phương pháp tiếp cận không xâm lấn đầu tiên được Cục quản lý dược phẩm và thực phẩm phê duyệt để phát hiện ACR sau HT dựa trên phân tích bảng điểm (25).
Research also has shown that WGS not only provides information about a graft but also a patient's virome and overall state of immunosuppression. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng WGS không chỉ cung cấp thông tin về mảnh ghép mà còn cả tình trạng suy giảm miễn dịch và tình trạng suy giảm miễn dịch nói chung của bệnh nhân. This represents a potentially great advantage unobtainable by other assays (26-28). Điều này thể hiện một lợi thế tiềm năng lớn không thể đạt được bằng các thử nghiệm khác (26-28).
However, WGS faces challenges that could prevent it from being implemented routinely in clinical practice. Tuy nhiên, WGS phải đối mặt với những thách thức có thể ngăn nó được thực hiện thường xuyên trong thực hành lâm sàng. For example, while a recipient's genetic information can be easily obtained, this is not always true for a donor. Ví dụ, trong khi thông tin di truyền của người nhận có thể dễ dàng thu được, điều này không phải lúc nào cũng đúng với người hiến. Moreover, WGS is costly, labor intensive, and time-consuming. Hơn nữa, WGS tốn kém, tốn nhiều công sức và tốn thời gian.
An alternative method employs a panel of genotyped polymorphic SNPs identified within the pool of extracted cfDNA thereby eliminating the need for a priori knowledge of a donor's specific genotype (29). Một phương pháp thay thế sử dụng một nhóm SNP đa hình có kiểu gen được xác định trong nhóm cfDNA được trích xuất, do đó loại bỏ nhu cầu hiểu biết về kiểu gen cụ thể của người hiến tặng (29). Unlike kidney and liver transplants, which often occur between closely related individuals, the donor-recipient pairs for heart and lung transplants typically are not related. Không giống như ghép thận và gan, thường xảy ra giữa các cá nhân có liên quan chặt chẽ với nhau, các cặp người hiến tặng cho ghép tim và phổi thường không liên quan. GTD requires genotyping of both the transplant recipient and donor. GTD yêu cầu kiểu gen của cả người nhận và người hiến. However, in practice, donor genotype information is often unavailable. Tuy nhiên, trong thực tế, thông tin kiểu gen của nhà tài trợ thường không có sẵn. Here, we address this issue by developing an algorithm that estimates dd-cfDNA levels in the absence of a donor genotype. Ở đây, chúng tôi giải quyết vấn đề này bằng cách phát triển một thuật toán ước tính mức độ dd-cfDNA trong trường hợp không có kiểu gen của nhà tài trợ. Our algorithm predicts heart and lung allograft rejection with an accuracy that is similar to conventional GTD. Thuật toán của chúng tôi dự đoán từ chối allograft tim và phổi với độ chính xác tương tự như GTD thông thường. We furthermore refined the algorithm to handle closely related recipients and donors, a scenario that is common in bone marrow and kidney transplantation. Ngoài ra, chúng tôi còn tinh chỉnh thuật toán để xử lý người nhận và người hiến liên quan chặt chẽ, một kịch bản phổ biến trong ghép tủy xương và ghép thận. We show that it is possible to estimate dd-cfDNA in bone marrow transplant patients who are unrelated or who are siblings of the donors, using a hidden Markov model. Chúng tôi cho thấy rằng có thể ước tính dd-cfDNA ở những bệnh nhân ghép tủy xương không liên quan hoặc là anh em ruột của các nhà tài trợ, sử dụng mô hình Markov ẩn. Therefore, algorithms have been developed for heart and lung transplants which assume that the donor's genotype occurs at the same frequency as the general population. Do đó, các thuật toán đã được phát triển cho các ca ghép tim và phổi, giả định rằng kiểu gen của người hiến tặng xảy ra ở cùng tần số với dân số nói chung. Based on these frequencies and comparison to the known genotype of the recipient, the fraction of dd-cfDNA can be reliably estimated from the total pool of cfDNA isolated from a recipient's plasma sample. Dựa trên các tần số này và so sánh với kiểu gen đã biết của người nhận, tỷ lệ dd-cfDNA có thể được ước tính một cách đáng tin cậy từ tổng số cfDNA được phân lập từ mẫu huyết tương của người nhận.
In the case of lung transplantation, this single-genome model, when compared to the methodology using both donor and recipient genotypes, was found to provide comparable fractions of dd-cfDNA. Trong trường hợp ghép phổi, mô hình bộ gen đơn này, khi so sánh với phương pháp sử dụng cả kiểu gen của người cho và người nhận, đã được tìm thấy để cung cấp các phân số tương đương của dd-cfDNA. However, when researchers applied this same algorithm to HT, the estimated levels of dd-cfDNA were not as strongly correlated as in lung transplants. Tuy nhiên, khi các nhà nghiên cứu áp dụng thuật toán tương tự này cho HT, mức độ ước tính của dd-cfDNA không tương quan mạnh như trong cấy ghép phổi. This might be related to the lower absolute amounts of dd-cfDNA present after HT. Điều này có thể liên quan đến lượng dd-cfDNA tuyệt đối thấp hơn sau HT. This is another example of organ-specific cfDNA kinetics that can influence assay results and must be taken into account (30). Đây là một ví dụ khác về động học cfDNA dành riêng cho cơ quan có thể ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm và phải được tính đến (30).
In the case of renal transplantation, prospective studies have been conducted to ascertain the utility of dd-cfDNA levels, identified using known donor-specific SNPs, as a viable marker for rejection. Trong trường hợp ghép thận, các nghiên cứu tiền cứu đã được tiến hành để xác định công dụng của nồng độ dd-cfDNA, được xác định bằng cách sử dụng SNPs dành riêng cho người hiến, như một dấu hiệu khả thi để từ chối. In one such study, 384 kidney recipients were recruited from 14 clinical sites to provide blood samples at scheduled intervals and at times of clinically indicated biopsies (31). Trong một nghiên cứu như vậy, 384 người nhận thận đã được tuyển dụng từ 14 vị trí lâm sàng để cung cấp các mẫu máu theo các khoảng thời gian theo lịch trình và tại các thời điểm sinh thiết được chỉ định lâm sàng (31). Overall, the study focused on the correlation between the histology in 107 biopsy specimens from 102 patients and the levels of dd-cfDNA found in matched plasma samples. Nhìn chung, nghiên cứu tập trung vào mối tương quan giữa mô học trong 107 mẫu sinh thiết từ 102 bệnh nhân và nồng độ dd-cfDNA được tìm thấy trong các mẫu huyết tương phù hợp. More specifically, 27 biopsy samples from 27 patients with active rejection were obtained along with 80 biopsy samples from 75 patients without active rejection. Cụ thể hơn, 27 mẫu sinh thiết từ 27 bệnh nhân bị từ chối hoạt động đã được lấy cùng với 80 mẫu sinh thiết từ 75 bệnh nhân mà không từ chối hoạt động.
In this study, active rejection included acute antibody-mediated rejection (AMR), chronic AMR, and ACR. Trong nghiên cứu này, thải ghép tích cực bao gồm thải ghép kháng thể cấp tính (AMR), AMR mạn tính và ACR. The assay used in this study employed a 1% cutoff for the fraction of dd-cfDNA to indicate the presence or absence of active rejection and was found to have 85% specificity (95% CI, 79%–91%) and 59% sensitivity (95% CI, 44%–74%). Thử nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu này đã sử dụng mức cắt 1% cho phần dd-cfDNA để chỉ ra sự hiện diện hay vắng mặt của sự từ chối hoạt động và được phát hiện có độ đặc hiệu 85% (95% CI, 79% Nott91%) và độ nhạy 59% (KTC 95%, 44% mật74%). The sensitivity of this assay was greater for discriminating between active and absent AMR, as the use of a cutoff of 1% dd-cfDNA was found to have an 83% specificity (95% CI, 78%–89%) and 81% sensitivity (95% CI, 67%–100%). Độ nhạy của xét nghiệm này cao hơn khi phân biệt giữa AMR hoạt động và vắng mặt, vì việc sử dụng mức cắt 1% dd-cfDNA đã được tìm thấy có độ đặc hiệu 83% (95% CI, 78% Nott89%) và độ nhạy 81% (KTC 95%, 67% mật 100%). Notably, in both cases, the sensitivity declined substantially when the fraction of dd-cfDNA exceeded 3%. Đáng chú ý, trong cả hai trường hợp, độ nhạy giảm đáng kể khi tỷ lệ dd-cfDNA vượt quá 3%.
To improve specificity and sensitivity of a non-invasive cfDNA-based assay to detect rejection following renal transplantation, investigators also have surveyed the absolute amount of dd-cfDNA (32-33). Để cải thiện tính đặc hiệu và độ nhạy của xét nghiệm cfDNA không xâm lấn để phát hiện thải ghép sau ghép thận, các nhà điều tra cũng đã khảo sát lượng dd-cfDNA tuyệt đối (32-33). By interrogating the absolute amount of dd-cfDNA, one can eliminate the artificial changes in the fraction of dd-cfDNA due to increases in total cfDNA levels caused by non-rejection events, such as infection, trauma, or exercise, potentially creating a more accurate assay. Bằng cách thẩm vấn số lượng tuyệt đối của dd-cfDNA, người ta có thể loại bỏ các thay đổi nhân tạo trong phần của dd-cfDNA do tăng tổng mức cfDNA gây ra bởi các sự kiện không từ chối, chẳng hạn như nhiễm trùng, chấn thương hoặc tập thể dục, có khả năng tạo ra nhiều hơn khảo nghiệm chính xác.
To investigate this possibility, one study employed 32 informative copy number variants (CNVs) based on population frequencies, as opposed to relative proportions of donor and recipient SNPs at given loci (32). Để điều tra khả năng này, một nghiên cứu đã sử dụng 32 biến thể số bản sao thông tin (CNV) dựa trên tần số dân số, trái ngược với tỷ lệ tương đối của SNP của người cho và người nhận tại địa phương cụ thể (32). All CNVs not present within a recipient's genome but present within the extracted cfDNA were therefore assumed to represent dd-cfDNA. Do đó, tất cả các CNV không có trong bộ gen của người nhận nhưng hiện diện trong cfDNA được trích xuất do đó được giả sử là đại diện cho dd-cfDNA.
Interestingly, while the specificity and sensitivity improved overall with the use of absolute dd-cfDNA levels, this assay also had a greater capacity to distinguish between the presence and absence of active AMR, as opposed to cases of active ACR. Điều thú vị là, mặc dù độ đặc hiệu và độ nhạy được cải thiện tổng thể khi sử dụng nồng độ dd-cfDNA tuyệt đối, xét nghiệm này cũng có khả năng lớn hơn để phân biệt giữa sự hiện diện và không có AMR hoạt động, trái ngược với các trường hợp ACR hoạt động. In addition, serum creatinine levels were not sufficient in discriminating between active rejection and quiescence, likely because it is more indicative of glomerular function as opposed to kidney tissue damage (31-33). Ngoài ra, nồng độ creatinine trong huyết thanh không đủ để phân biệt giữa thải ghép tích cực và không hoạt động, có thể là do nó biểu hiện nhiều hơn về chức năng của cầu thận so với tổn thương mô thận (31-33).
Another study explored the absolute levels of dd-cfDNA in kidney transplant recipients related to levels of tacrolimus, an immunosuppressant (33). Một nghiên cứu khác đã khám phá mức độ tuyệt đối của dd-cfDNA ở những người nhận ghép thận liên quan đến mức độ tacrolimus, một chất ức chế miễn dịch (33). Here, the researchers found that the absolute amount of dd-cfDNA was substantially higher in patients with lower tacrolimus levels (<8 μg/L) in comparison to those with higher drug levels. Tại đây, các nhà nghiên cứu nhận thấy rằng lượng dd-cfDNA tuyệt đối cao hơn đáng kể ở những bệnh nhân có nồng độ tacrolimus thấp hơn (<8 g / L) so với những người có nồng độ thuốc cao hơn. These data suggest that dd-cfDNA levels also have the potential to detect allograft injury resulting from inadequate immunosuppression. Những dữ liệu này cho thấy rằng nồng độ dd-cfDNA cũng có khả năng phát hiện chấn thương do allograft do ức chế miễn dịch không đầy đủ.
Laboratories also have proposed alternatives to WGS. Các phòng thí nghiệm cũng đã đề xuất các giải pháp thay thế cho WGS. Our group explored targeted sequencing of 124 highly polymorphic (minor allele frequency [MAF] >0.4) SNPs using a commercially available panel, next-generation sequencing, and a novel algorithm (34). Nhóm của chúng tôi đã khám phá trình tự được nhắm mục tiêu của 124 SNPs đa hình (tần số alen nhỏ [MAF]> 0,4) sử dụng bảng điều khiển có sẵn trên thị trường, giải trình tự thế hệ tiếp theo và thuật toán mới (34). This approach significantly reduced the total amount of sequencing required, decreasing costs and assay time, and enabling rapid analysis. Cách tiếp cận này làm giảm đáng kể tổng số lượng trình tự cần thiết, giảm chi phí và thời gian khảo nghiệm và cho phép phân tích nhanh chóng. However, since this assay relies upon differences in MAF between individuals, it would not be robust for closely related donor–recipient pairs, such as seen in living-related kidney donation. Tuy nhiên, do xét nghiệm này phụ thuộc vào sự khác biệt về MAF giữa các cá nhân, nên sẽ không mạnh mẽ đối với các cặp người nhận hiến tặng liên quan chặt chẽ, như được thấy trong hiến thận liên quan đến cuộc sống. It remains to be validated for detecting moderate or greater rejection events. Nó vẫn còn được xác nhận để phát hiện các sự kiện từ chối vừa hoặc lớn hơn.
Laboratories also have explored using polymorphic SNPs to quantify dd-cfDNA combined with the technology of digital droplet PCR (30,35-37). Các phòng thí nghiệm cũng đã khám phá bằng cách sử dụng SNP đa hình để định lượng dd-cfDNA kết hợp với công nghệ PCR giọt nhỏ kỹ thuật số (30,35-37). Using 41 highly polymorphic SNPs, stable kidney and HT recipients showed dd-cfDNA fractions of 2%–3% with stable liver transplant recipients having a level of 7% (35). Sử dụng 41 SNP đa hình cao, người nhận thận và HT ổn định cho thấy phân số dd-cfDNA là 2% 3% với người nhận ghép gan ổn định có mức 7% (35).
KẾT LUẬN
The use of a costly and invasive tissue biopsy to detect allograft rejection has significant limitations. Việc sử dụng sinh thiết mô tốn kém và xâm lấn để phát hiện thải ghép allograft có những hạn chế đáng kể. As such, a minimally invasive assay that can directly and accurately assess the health of the entire transplanted organ represents a holy grail in solid organ transplantation. Như vậy, một xét nghiệm xâm lấn tối thiểu có thể đánh giá trực tiếp và chính xác sức khỏe của toàn bộ cơ quan cấy ghép đại diện cho một chén thánh trong ghép tạng rắn.
The use of cfDNA after transplantation has shown some initial promise, but further study and validation is required to improve our understanding of both the basic biology of cfDNA as well as its behavior post-transplant. Việc sử dụng cfDNA sau khi ghép đã cho thấy một số hứa hẹn ban đầu, nhưng cần nghiên cứu thêm và xác nhận để cải thiện hiểu biết của chúng tôi về cả sinh học cơ bản của cfDNA cũng như hành vi sau ghép. At this time, it is clear that important organ-specific differences exist, and patterns of cfDNA release may also differ depending on the type of rejection event. Tại thời điểm này, rõ ràng có sự khác biệt quan trọng cụ thể của cơ quan và các kiểu phát hành cfDNA cũng có thể khác nhau tùy thuộc vào loại sự kiện từ chối. However, cfDNA represents one of the most promising technologies yet developed to complement or even ultimately replace the tissue biopsy. Tuy nhiên, cfDNA đại diện cho một trong những công nghệ hứa hẹn nhất được phát triển để bổ sung hoặc thậm chí cuối cùng thay thế sinh thiết mô.